به گزارش مجله زیست فن ، روش کریسپر–کَس۹ علی‌رغم نقش بسیار تعیین کننده‌اش، محدودیت‌هایی هم دارد. یکی از محققان در حوزه زیست‌مهندسی (bioengineering) از دانشگاه کالیفرنیا، می‌گوید: «این تکنیک برای رفتن به جایگاهی مشخص از ژنوم و برش آن، بسیار مناسب است، اما در برخی موارد عملیاتی‌کردن خواسته شما، به کمی بیش‌تر از این‌ها نیاز دارد.»
اشتیاقی که پژوهشگران، چندی پیش در نقد به NgAgo — یک روش احتمالی نوپدید ویرایش ژن — از خود نشان دادند، ناامیدی از کریسپر–کَس۹ و عزمی محکم برای یافتن روش‌های جایگزین را در لایه‌هایی پنهانی آشکار کرد.
گنجینه ابزارهای ویرایش ژنی در حال گسترش است و NgAgo تنها یکی از آن‌هاست. برخی، حاصل دگرگونی‌هایی در زمینه کریسپر هستند و برخی دیگر راه‌هایی جدید برای ویرایش ژنوم را ارائه می‌کنند.
یک نسخه کوچک‌تر
شاید روزی فرا برسد که از کریسپر–کَس۹ برای بازنویسی ژن‌های عامل بیماری‌های ژنتیکی استفاده شود. اما اجزای سیستم — آنزیمی به نام کَس۹ و رشته‌ای از آر.ان.اِی که آنزیم را به سمت توالی هدف راهبری می‌کند — برای جای‌گرفتن در ژنوم ویروسی که معمولاً در ژن‌درمانی برای انتقال ماده ژنتیکی بیگانه به داخل سلول‌های انسانی استفاده می‌شود، بسیار بزرگ است.
استفاده از mini-cas9 که از باکتری استافیلوکوکوس اورئوس گرفته شده است، یکی از راه‌حل‌هاست. این پروتئین آن‌قدر کوچک هست که بتواند به ویروس مورد استفاده در یکی از ژن‌درمانی‌های متداول، نفوذ کند. در دسامبر ۲۰۱۵، دو گروه تحقیقاتی، از نسخه‌کوچک‌تر کَس۹ استفاده کردند تا ژن عامل دیستروفی عضلانی دوشن در موش‌ها را تصحیح کنند.
دسترسی گسترده
کَس۹ برای برش جایی که به آن هدایت شده، به وجود یک توالی مشخص دی.اِن.اِی در آن نزدیکی نیازمند است. این نیاز در اکثر ژنوم‌ها پاسخ داده می‌شود، اما می‌تواند یک محدودیت آزاردهنده در برخی از آزمایش‌ها باشد. پژوهشگران با هدف گسترش تعداد توالی‌های قابل تغییر، به میکروب‌ها برای تامین آنزیم‌هایی با نیاز به توالی‌های متمایز، امید بسته‌اند.
Cpf1، یکی از آن آنزیم‌هاست و ممکن است یکی از جایگزین‌های جذاب باشد؛ زیرا از کَس۹ کوچک‌تر است، به توالی‌های متمایزی نیاز دارد و بسیار اختصاصی است.
آنزیمی دیگر، به نام C2c2، به جای دی.اِن.اِی، آر.اِن.اِی را هدف قرار می‌دهد، شاخصه‌ای که ظرفیت مطالعه آر.اِن.اِی و مقابله با ویروس‌هایی با ژنوم آر.اِن.اِی را در خود دارد.
ویراشگران حقیقی
بسیاری از آزمایشگاه‌ها از کریسپر–کَس۹ فقط برای حذف بخش‌هایی از یک ژن و در نتیجه توقف عملکرد آن، استفاده می‌کنند.آن‌هایی که بخواهند یک توالی را با توالی دیگری معاوضه کنند با کار سخت‌تری روبرو هستند. وقتی کَس۹ دی.اِن.اِی را برش می‌زند، معمولا سلول در هنگام دوختن دو انتهای بریده به یکدیگر اشتباهاتی انجام می‌دهد؛ این اشتباهات، حذف‌هایی را منجر می‌شود که مطلوب بسیاری از پژوهشگران است.
اما محققینی که بخواهند یک توالی دی.اِن.اِی را بازنویسی کنند، بر مسیر بازسازی دیگری با توان درج و جای‌گذاری یک توالی جدید، تکیه می‌کنند؛ فرآیندی که به نسبت روند نقص‌پذیر دوختن با بسامد بسیار کمتری رخ می‌دهد.
پیشرفت‌ها در ماه‌های اخیر، دانشمندان را امیدوار کرده است. طبق ادعای پژوهشگران که به ماه آوریل برمی‌گردد، آن‌ها کَس۹ را از کار انداخته و آنزیمی که یک حرف از دی.اِن.اِی را به دیگری تبدیل می‌کند، به آن متصل کرده‌بودند. نسخه کم‌توان کَس۹، هنوز هم توالی تحمیل‌شده توسط آر.اِن.اِی راهبر را هدف گرفت، اما نمی‌توانست برش بزند، اما در عوض، آنزیم متصل‌شده حرف‌های دی.اِن.اِی را جابه‌جا کرد.
دانشمندان امیدوارند تا اتصال آنزیم‌های دیگر به کَس۹ کم‌توان، تغییرات توالی‌های متنوعی را امکان‌پذیر سازد.
پیگیری آرگونات‌ها
در ماه مِی، مقاله‌ای در مجله Nature Biotechnology، یک سیستم ویرایش ژنی بدیع را معرفی کرد. پژوهشگران مدعی شدند، می‌توان با استفاده از پروتئینی از خانواده آرگونات‌ها به نام NgAgo، جایگاه معینی از دی.اِن.اِی را بدون نیاز به یک آر.اِن.اِی راهبر و یا حضور توالی مشخصی از ژنوم در همسایگی آن، برش زد؛ در عوض، پروتئین یادشده — که توسط یک باکتری ساخته می‌شود — با استفاده از یک توالی کوتاه دی.اِن.اِی که با قطعه هدف همخوانی دارد، برنامه‌نویسی می‌شود.
این یافته موجی از هیجان و گمانه‌زنی در مورد کنارگذاشتن کریسپر–کَس۹ را آغاز کرد، اما آزمایشگاه‌ها تاکنون در بازتولید نتایج ناموفق بوده‌اند. با این وجود، این امید وجود دارد که پروتئین‌های دیگری از خانواده آرگونات‌ها که توسط دیگر باکتری‌ها تولید می‌شوند، راهی به جلو را میسر سازند.
برنامه‌ریزی آنزیم‌ها
سیستم‌های ویرایش ژنی دیگری هم در حال توسعه هستند؛ به طور مثال، برای یک پروژه گسترده با هدف ویرایش ژن‌ها در باکتری، پژوهشگران هرگز به سمت کریسپر حرکت نکردند. در عوض، تیم تحقیقاتی عمدتا بر روی سیستمی به نام Lambda Red تکیه کرد؛ با برنامه‌نویسی این سیستم می‌توان توالی دی.اِن.اِی را بدون نیاز به آر.اِن.اِی راهنما، تغییر داد. اما با وجود ۱۳ سال پژوهش، Lambda Red فقط در باکتری عمل می‌کند.
محققین پروژه می‌گویند آزمایشگاه‌هایشان در حال کار روی آنزیم‌های integrase و recombinase برای استفاده به عنوان ویرایشگر ژن هستند.