Taq پلیمراز، DNA پلیمراز پایدار در برابر حرارت است که از باکتری گرمادوست Thermus aquaticus استخراج می شود.
به گزارش سیناپرس همدان، عملکرد غالب آن در تکنیک واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) است که در آن مرحله تکراری تکثیر توالی‌های DNA خاص را خودکار می‌کند. واکنش زنجیره ای پلیمراز می تواند مولکول های DNA را تا یک میلیارد برابر تکثیر کند. این باعث تولید مقادیر زیادی از ژن های خاص با استفاده پایین دستی در چندین برنامه می شود.
Taq DNA پلیمراز در خانواده ای از DNA پلیمرازهای معروف به خانواده A گنجانده شده است. PCR از DNA پلیمرازهای هر دو (به طور انحصاری) DNA پلیمرازهای خانواده A و خانواده B استفاده می کند. خانواده DNA پلیمرازها شامل Tth و Tma DNA پلیمراز در کنار Taq هستند و دارای فعالیت اگزونوکلئاز ‘5 به ‘3 هستند، اما به طور معمول فاقد ‘3 به ‘5 هستند. در غیاب فعالیت اگزونوکلئاز ‘3 به ‘5، پلیمرازهای خانواده A در هنگام ترکیب جفت بازها، مستعد خطا هستند.
برعکس، DNA پلیمرازهای خانواده B دارای صحت (یا تصحیح) بالایی هستند. این خانواده شامل Pfu، Kod و Tli است. آنها دارای فعالیت اگزونوکلئاز ‘3 به ‘5 ذاتی هستند اما فاقد فعالیت اگزونوکلئاز ‘5 به ‘3 می باشند. این امر حذف نوکلئوتیدهای نادرست در طول سنتز DNA را امکان پذیر می کند که دقت آنها را نسبت به پلیمرازهای خانواده A افزایش می دهد.
تقویت PCR به طور خلاصه
مراحل درگیر در تکنیک PCR شامل انکوباسیون DNA با پرایمر اضافی مخصوص توالیِ ژنومیِ انتخاب شده است. DNA پلیمراز مسئول گسترش پرایمرها با استفاده از رشته های هدف، به عنوان الگو است.
- دناتوراسیون (94 درجه سانتیگراد): پس از انکوباسیون، مخلوط PCR برای جداسازی رشته های DNA حرارت داده می شود.
- بازپخت (Annealing) (55-65 درجه سانتیگراد): این پرایمرها را قادر می سازد تا با نواحی مکمل DNA تازه تکثیر شده هیبرید شوند.
- طویل سازی (72 درجه سانتی گراد): تکثیر آنزیمی با واسطه Taq پلیمراز توالی های متصل به پرایمر. این عمل تقریبا با سرعت 60 باز در ثانیه در دمای 70 درجه سانتیگراد رخ می دهد.
این فرآیند چندین بار تکرار می شود تا تعداد کپی افزایش یابد. استفاده از یک DNA پلیمراز ترموفیل مانند Taq polymerase از دناتوره شدن آنزیم در طول مرحله Annealing که برای جداسازی رشته جدید سنتز شده ضروری است جلوگیری می کند، این متعاقباً تکنیک PCR را ساده می کند و کارایی آن را افزایش می دهد.
سینتیک آنزیم تاک پلیمراز
Taq پلیمراز فعالیت آنزیمی قابل توجهی را در دمای 37 درجه سانتیگراد نشان می دهد. با این حال، در دمای بسیار بالاتر (72 درجه سانتیگراد) به طور بهینه عمل می کند. نوکلئوتیدها با سرعت دو تا چهار کیلو باز در دقیقه ترکیب می شوند.
با این حال، عملکرد در این دما امکان تکثیر غیر اختصاصی را فراهم می کند که با رویدادهای پرایمینگ اشتباهی که در مرحله اولیه واکنش PCR رخ می دهد، همراه است. طویل سازی می تواند از آغازگرهای الیگودئوکسی نوکلئوتید که به طور غیر اختصاصی به DNA الگو قبل از اولین مرحله دناتوراسیون، که در دمای 93-95 درجه سانتیگراد رخ می دهد، ایجاد شود.
مکانیسم هایی برای دور زدن این امر شامل استفاده از یک مهارکننده حرارت پذیر است که فعالیت Taq پلیمراز را تا زمانی که در اثر حرارت غیرفعال نشود مسدود می کند. در نتیجه، Taq پلیمراز تنها زمانی فعال می شود که دما آنتی بادی مونوکلونال را در طول دناتوراسیون اولیه واکنش PCR از بین ببرد. این وسیله مهار با واسطه آنتی بادی Taq پلیمراز اجازه می دهد تا مخلوط واکنش PCR در دمای اتاق در کنار هم جمع شود. به این ترتیب، تکثیرغیر اختصاصی در موارد ناشی از رویدادهای پرایمینگ اشتباه حذف می شود یا کاهش می یابد.
محدودیت‌های Taq Polymerase و مقایسه با خانواده B DNA پلیمرازها
اگرچه Taq DNA پلیمرازها یک آنزیم استاندارد طلایی در کاربردهای PCR هستند، اما محدودیت‌های آنها ترکیب آنها را در کاربردهای پیچیده‌تر محدود می‌کند.
Taq DNA پلیمراز مقاوم در برابر حرارت، به عنوان استاندارد صنعتی در نظر گرفته می شود که برای طیف گسترده ای از کاربردهای PCR مناسب است. با این حال، عملکرد Taq در کاربردهای چالش برانگیزتر، مانند مواردی که نیاز به سنتز با صحت بالا آمپلیکون های طولانی (> 2 کیلوباز) دارند، و تکثیر توالی های غنی از باز های G و C محدود است.
مهمتر از همه، Taq DNA پلیمراز به دلیل فقدان فعالیت تصحیح ‘3 به ‘5 فاقد فعالیت تصحیح کننده است. این امر منجر به کاهش نرخ فعالیت پلیمرازی آن می شود که بین یک تا 10000 باز تخمین زده می شود، اما صحت آن را به خطر می اندازد. مقایسه نرخ خطای جایگزینی باز بین پلیمرازهای غیر تصحیح کننده و تصحیح کننده زیاد است. به ترتیب 10تا2 تا 10تا6 در مقابل 10تا6 تا 10تا7 می باشد.
در مقابل، DNA پلیمرازهای نوع B آرکیایی، می توانند بازهای نادرست را به دلیل فعالیت اگزونوکلئاز ‘3 به ‘5 حذف کنند و در نتیجه صحت بالاتری داشته باشند. اینها شامل Pfu DNA پلیمراز (از آرکئا پیروکوکوس فوریوسوس) است که 4 برابر پایدارتر از Taq DNA پلیمراز در دمای 95 درجه سانتیگراد است (اگرچه در شرایط آزمایشگاهی روند محدودی (<20 باز) را نشان می دهد.
KOD DNA پلیمراز مشتق شده از Thermococcus kodakarensis یکی دیگر از DNA پلیمراز آرکیایی نوع B است که هر دو فعالیت اگزونوکلئاز ‘3 به ‘5 (تصحیح) را نشان می دهد. دمای بهینه DNA پلیمراز KOD 75) درجه سانتیگراد) و فرکانس جهش (3.5×10-3) شبیه به Pfu DNA پلیمراز است، اما نرخ ازدیاد طول حدود 5 برابر (100-130 نوکلئوتید در ثانیه)، 10-15 برابر پردازش بیشتر؛ تکثیر توالی های غنی از G و C و توانایی عملکرد با استفاده از نمونه های خام را ارائه می دهد.
در مجموع، این ویژگی‌ها طول زمان اجرای PCR را کاهش می‌دهند که منجر به کاهش 66 درصدی زمان نسبت به PCR با واسطه Taq می‌شود.
منبع: news-medical.net
مترجم: سید سپهر ارومیهء